Значит гибернация для межзвёздных перелётов не подходит. Только анабиоз, причём, желательно при Т близких к абс. 0.
Температуры жидкого азота вполне достаточно:
Benjamin P. Best "Scientific justification of cryonics practice.""...При отсутствии кровообращения в условиях пониженной температуры в тканях тела необратимые изменения наступают значительно позже. Сообщалось о большом количестве случаев выживания с полным восстановлением нормальной нервной деятельности после остановки сердца в течение от 20 минут до часа и более (особенно у детей) в условиях гипотермии, например при утопании в холодной воде [1,2]. Уровень метаболизма при охлаждении значительно падает.
Как было показано в опытах на песчанках, длительность ишемии, приводящей к повреждению 50% нейронов, растёт экспоненциально при снижении температуры мозга с 37ºC до 31ºC [3]. Шесть из шести собак, введенных в гипотермическое состояние до температуры (измеряемой на барабанной перепонке) 10ºC, показали полное восстановление без какого-либо повреждения нервной системы после 90-минутной остановки сердца; две из семи перенесли аналогичное состояние в течение 120 минут без видимого нарушения нервной деятельности [4]. Пациентов погружают в гипотермическое состояние с остановкой сердца более чем на час для операций на аорте без ощутимого ущерба для нервной системы. Люди, испытавшие состояние электрического молчания мозга (нулевой биспектральный индекс на ЭЭГ) при температурах между 16ºC и 24ºC [5], возвращаются в нормальное состояние без ущерба для нервной системы, что подтверждает возможность утраты и восстановления динамической активности мозга без потери личности.
Гипотермическую защиту от повреждения в условия ишемии можно видеть на примере лесной лягушки (Rana sylvatica) которая выживает в полузамороженном состоянии без сердцебиения месяцами при температурах от -3ºC до -6ºC с полным восстановлением после отогревания [6]. В 1966 году японский исследователь заменил кровь в мозгу кошки на глицерин с целью уменьшения образования льда и охладил до -20ºC. Мозг пробыл при этой температуре и в отсутствии кровообращения 45 дней, после чего был оживлен и демонстрировал нормальную ЭЭГ [7].
Отношение между скоростью химической реакции (k) (включая процессы обмена и ишемического повреждения тканей) и температурой (T) может быть описано уравнением Аррениуса [8]:
k = A exp ( E
a/RT)
где: T - Температура в Кельвинах, E
a - энергия активации, R - универсальная газовая постоянная (8,314 Дж/моль*Кельвин), A - частотный коэффициент (учитывающий частоту молекулярных соударений и вероятность, что соударение происходит с ориентацией, благоприятствует протеканию реакции). Взяв натуральный логарифм от обеих частей уравнения получаем:
ln k = (-E
a/RT) + ln A
Для двух различных температур, T
1 и T
2, будет различной и зависимость скорости реакции от температуры, k1 и k2:
ln k
1 = (-E
a/RT
1) + ln A
ln k
2 = (-E
a/RT
2) + ln A
Вычитание ln k
2 из ln k
1 дает уравнение первой степени с четырьмя переменными:
ln k
1 - ln k
2 = ((- E
a/RT
1) + ln A) - ((-E
a/RT
2) + ln A)
которое может быть упрощено до:
ln (k
1/k
2) = (E
a/R)×(1/T
2 - 1/T
1)
или k
1/k
2 = e
(Ea/R)×(1/T2 - 1/T1)Скорость ферментативных реакций при различных температурах дает хорошее приближение зависимости между температурой и уровнем метаболизма. Лактатдегидрогеназа мышц кролика с энергией активации (E
a) 13100 калорий/моль[9] может рассматриваться как типичный фермент. Одна термохимическая калория равна 4.184 Дж, что дает 54810 Дж/моль.
Сравнение скорости протекания реакции (k
1) для лактатдегидрогеназы при 40ºC (313 К) (T
1) со скоростью реакции (k
2) при 30ºC (303 К) (T
2) дает:
k
1/k
2 = e
((54,810 J/mol)/(8.314 J/mol*K))×(1/303 K - 1/313 K) = 2.004
Скорость протекания реакции при 40ºC вдвое превышает скорость реакции при 30ºC или, напротив, падение температуры на 10ºC снижает скорость реакции наполовину. Это согласуется с правилом Вант-Гоффа - эмпирическим правилом, согласно которому при температурах между 0ºC и 40ºC скорость реакции уменьшается в 2-3 раза при снижении температуры на 10ºC[10].
Такое экспоненциальное уменьшение скорости реакций со снижением температуры означает, что скорость их протекания становится исчезающе малой при криогенных температурах (ниже -100ºC), если они возможны при таких условиях. В приведенной таблице, полученной с использованием предыдущего уравнения сравниваются скорость протекания реакции при 37ºC (310 Кельвинов, нормальная температура человеческого тела) и скорости реакций при более низких температурах.
Скорость реакции при низких температурах по сравнению с 37ºC
Температура / Эталон / По отношению к 37ºC / По отношению к 6 мин. при 37ºC
0ºC (273 K) / таяние льда / 18 лет / 1,8 часа
-80ºC (193 K) / сухой лед / 400000 лет / 4,5 года
-120ºC (153 K) / переход в стеклообразное состояние / 3 миллиарда (3x10
9) / 34000 лет
-196ºC (77 K) / кипение азота / 9x10
27 / (10
23) лет
Если взять лактатдегидрогеназу как типичный фермент, то скорость метаболизма при 37ºC будет в 18 раз выше чем при 0ºC. Экспериментально наблюдался уровень окислительного фосфорилирования при 4ºC составлявший 1/20 от такового при 37ºC [11], что приблизительно соответствует вычисленному.
Скорость реакции в 9 октиллионов раз более высокая при температуре человеческого тела чем при -196ºC означает, что при низкой температуре практически не будет происходить реакций в течение тысячелетий. При температуре жидкого азота потребуется 100 секстиллионов лет, чтобы протекли те ишемические биохимические реакции, которые при 37ºC произойдут за 6 минут. Но даже эти цифры преуменьшают химическую инертность при криогенных температурах, так как уравнение Аррениуса справедливо для жидкостей или газов, в которых возможно обычное химическое взаимодействие. При температурах ниже -130ºC ткани млекопитающих переходят в твердое стекловидное состояние с вязкостью более 10
13 пуаз [12,13], что более чем в 10
15 раз выше, чем вязкость воды при температуре 20ºC. В результате этого скорость диффузии незначительна даже в геологических масштабах времени. При температуре жидкого азота ткани млекопитающих могут даже быть на протяжении многих столетий устойчивы к фоновой радиации [12].
Мнение, что при заморозке тканей млекопитающих всегда происходит образование льда внутри клеток, приводящее к их разрыву, является заблуждением. При охлаждении тканей, вода осмотически покидает клетки, после чего образуются внеклеточные кристаллы изо льда без примесей. Не замёрзший жидкий остаток содержит всё более высокую концентрацию токсичных электролитов. В дальнейшем образуется столько внеклеточного льда, что он разрушает клетки в оставшихся незамороженными каналах [12]. Вопрос о том, что является основной причиной повреждений клеток при образовании льда во время медленного охлаждения - механические повреждения или токсичные концентрации электролитов - остаётся предметом споров среди криобиологов [15]. Практика же современной крионики направлена на уменьшение или, даже, исключение кристаллизации.
Ветрификация и криогенное хранениеВ крионике долгое время искали способ предотвратить образование льда в тканях с помощью препятствующих замерзанию веществ - криопротекторов, первоначально в основном глицерина. В 2007 г. обе основные крионические организации (Alcor Life Extension Foundation и Cryonics Institute) заявили, что они, с помощью витрифицирующегося раствора, исключили образование льда в головном мозгу; подобного заявления о других органах и тканях сделано не было.
Витрификация является затвердеванием в аморфное (стеклоподобное) состояние, отличающиеся от кристаллического льда. Чистая вода может витрифицироваться при охлаждении со скоростью не меньшей, чем три миллиона Кельвинов за секунду [18], подобная скорость для тканей животных является недостижимой. Несмотря на отсутствие фазового перехода из жидкого в кристаллическое состояние при температуре плавления/кристаллизации, витрификация сопровождается значительным увеличением вязкости вещества (называемым затвердеванием), которое происходит при температуре стеклования (T
g), что определяется скоростью охлаждения.
Наиболее часто используемые криопротекторы включают в себя диметилсульфоксид (ДМСО), а также этиленгликоль (автомобильный антифриз), пропиленгликоль (ранее использовавшийся как добавка против образования ледяных кристаллов в мороженом) и глицерин (используется с 1950-х годов для криоконсервирования спермы и клеток крови). Все эти соединения способны к созданию водородных связей с молекулами воды, что препятствует их организации в лед. Эти криопротекторы также препятствуют формированию молекулярной решётки льда благодаря коллигативному эффекту. Смеси криопротекторов могут быть менее токсичны, чем чистые криопротекторы, и могут полностью устранить льдообразование. Использование блокаторов льда (не криопротекторов, таких как препятствущие замораживанию протеины, которые химически блокируют рост кристаллов льда) в витрификационные смеси может еще больше снизить токсичность и концентрации, необходимых для витрификации [19].
Трудность достижения достаточно высокой концентрации криопротекторов для ликвидирования льдообразования, одновременно минимизируя повреждений от токсичности криопротекторов, и является ограничивающим фактором, препятствующим лучшему восстановлению биологических систем после криоконсервации. Быстрое охлаждение может позволить использование более низкие концентрации криопротекторов для предотвращения льдообразования, но быстрое охлаждение становится затрудненным с увеличением объёма тканей. Токсичность криопротекторов снижается при низких температурах, и использование менее вязких смесей криопротекторов позволяет увеличить скорость проникновения их в ткани и, тем самым, сократить время воздействия криопротекторов на ткани при более высоких температурах до охлаждения.
Предлагался ряд возможных объяснений токсичности криопротекторов, однако точные молекулярные механизмы остаются неизвестными [20]. Поскольку криопротекторы не разрушают молекулы, то ущерб наносимый ими не обязательно должен быть невосполнимым. Кроме того, значительный успех был достигнут в направлении снижения токсичности витрификационных смесей [21,22], и нет никаких оснований полагать, что дальнейшее снижение токсичности не может быть достигнуто. Наиболее изученным органом млекопитающих, в попытках витрификации органов является яичник. Переменный успех был достигнут с яичниками ряда видов, но наибольший успех был достигнут с яичниками мышей. Витрифицированные яичники мыши, криоконсервированные при -196 ºC, были повторно разогреты для произведения потомства, причём рождаемость была сопоставима с той, что наблюдалась при использовании свежих яичников [23].
В исследовании на срезах гиппокампа крыс показано, что клетки витрифицированных срезов, охлажденных до твёрдого состояния при -130 ºC, после повторного нагревания могут иметь жизнеспособность, сопоставимую с контрольными срезами, которые не были витрифицированы или криосохранены. Ультраструктура повторно разогретого среза региона CA1 (область мозга, наиболее страдающая при ишемии) выглядит достаточно хорошо сохранившейся в сравнении с ультраструктурой контрольной ткани CA1 [24]. Крионические организации перфузируют мозг витрификационным раствором до достижения насыщения.
Витрифицированные и криосохраненные ткани оцениваются как по жизнестойкости, так и по ультраструктуре. Для измерения жизнеспособности часто используется внутриклеточное соотношение ионов K
+/Na
+, хотя в будущем могут оказаться полезными и другие методы (такие как измерение концентрации АТФ в клетке). Натриевый насос, поддерживающий трансмембранный потенциал, не будет функционировать без связывания с АТФ и Na
+ внутри клеточной мембраны и K
+ вовне. Хотя клетка может поддерживать трансмембранный потенциал в течение нескольких часов и с нефункционирующим натриевым насосом, после этого протекание Na
+ внутрь клетки и сопутствующее вытекание K
+ из клетки приведут к полной потере трансмембранного потенциала. Аналогично, если клетка погибает в том смысле, что она более неспособна производить АТФ в митохондриях, то и натриевый насос прекратит работу. Таким образом, нормальное внутриклеточное соотношение K
+/Na
+ показывает как нормальное функционирование натриевых насосов, так и целостность клеточных мембран.
Чтобы проверить межклеточное соотношение K
+/Na
+, ткани помещают в маннитол для вымывания внеклеточных ионов. Затем используют трихлоруксусную кислоту для разрыва клеточных мембран и высвобождения внутриклеточных ионов. Для определения относительных концентраций натрия и калия можно использовать атомно-абсорбционный спектрометр или пламенный фотометр. Изучение жизнеспособности витрифицированных гипокампальных срезов при использовании межклеточных соотношений K
+/Na
+ показывает жизнеспособность более, чем в 90% по сравнению с нормой.
Почка кролика была витрифицирована, охлаждена до температуры -135ºC, затем снова разморожена и трансплантирована в кролика. Витрифицированный ранее трансплантат функционировал как единственная почка достаточно хорошо для поддержания кролика в живых неограниченное время [25]. Некоторые полагают, что для криосохранения мозга необходимо понимание механизма его функционирования. Но, если говорить упрощенно, почки производят мочу, а мозг продуцирует сознание. Размороженный после крионирования мозг, восстановленный физиологически, должен продуцировать сознание не менее эффективно, чем размороженная почка производит мочу. Сохранение структуры и восстановление физиологии должно обеспечить восстановление функциональности, независимо от вида органа или ткани.
Для сохранения почки кролика использовалсz витрификационный раствор M22. M22 также применяется для витрификации крионируемых пациентов организацией Алькор. Показано, что перфузии кроликов раствором M22 сохраняет ультраструктуру мозга без образования льда[26].
Охлаждение от 0ºC до -130ºC должно быть быстрым для минимизации возможности образования льда. При охлаждении от -130ºC до -196ºC термические напряжения в больших твёрдых образцах могут приводить к их растрескиванию и разламыванию [27]. Хотя существует теоретическая возможность достаточно медленного охлаждения до -196ºC, что дает возможность избежать растрескивания, точно неизвестна скорость такого охлаждения, и она может оказаться слишкой малой для практического использования. Снятие напряжений в витрифицированном образце при температурах в районе перехода его в стекловидное состояние может снять термические напряжения в нем[28], но этого может быть недостаточно...
ЛИТЕРАТУРА
1. Eich C, Brauer A, Kettler D. Recovery of a hypothermic drowned child after resuscitation with cardiopulmonary bypass followed by prolonged extracorporeal membrane oxygenation. Resuscitation. 2005 Oct;67(1):145-8.
2. Bolte RG, Black PG, Bowers RS, Thorne JK, Corneli HM. The use of extracorporeal rewarming in a child submerged for 66 minutes. JAMA. 1988 Jul 15;260(3):377-9.
3. Takeda Y, Namba K, Higuchi T, Hagioka S, Takata K, Hirakawa M, Morita K. Quantitative evaluation of the neuroprotective effects of hypothermia ranging from 34 degrees C to 31 degrees C on brain ischemia in gerbils and determination of the mechanism of neuroprotection. Crit Care Med. 2003 Jan;31(1):255-60.
4. Behringer W, Safar P, Wu X, Kentner R, Radovsky A, Kochanek PM, Dixon CE, Tisherman SA. Survival without brain damage after clinical death of 60-120 mins in dogs using suspended animation by profound hypothermia. Crit Care Med. 2003 May;31(5):1523-31.
5. Hayashida M, Sekiyama H, Orii R, Chinzei M, Ogawa M, Arita H, Hanaoka K, Takamoto S. Effects of deep hypothermic circulatory arrest with retrograde cerebral perfusion on electroencephalographic bispectral index and suppression ratio. J Cardiothorac Vasc Anesth. 2007 Feb;21(1):61-7.
6. Costanzo JP, Lee RE Jr, DeVries AL, Wang T, Layne JR Jr. Survival mechanisms of vertebrate ectotherms at subfreezing temperatures: applications in cryomedicine. FASEB J. 1995 Mar;9(5):351-8.
7. Suda I, Kito K, Adachi C. Viability of long term frozen cat brain in vitro. Nature. 1966 Oct 15;212(5059):268-70.
8. CHEMISTRY:The Central Science (Seventh Edition); pp.511-512; Brown,TL, et. al., Editors; Prentice Hall (1997).
9. Low PS, Bada JL, Somero GN. Temperature adaptation of enzymes: roles of the free energy, the enthalpy, and the entropy of activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1973 Feb;70(2):430-2.
10. Davidson EA, Janssens IA. Temperature sensitivity of soil carbon decomposition and feedbacks to climate change. Nature. 2006 Mar 9;440(7081):165-73.
11. Dufour S, Rousse N, Canioni P, Diolez P. Top-down control analysis of temperature effect on oxidative phosphorylation. Biochem J. 1996 Mar 15;314 ( Pt 3):743-51.
12. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol. 1984 Sep;247(3 Pt 1):C125-42.
13. Angell CA. Liquid fragility and the glass transition in water and aqueous solutions. Chem Rev. 2002 Aug;102(
:2627-50.
14. CRC Handbook of Chemistry and Physics (76th Edition),p.6-10, David R. Lido, Editor-in-Chief CRC Press (1995-1996).
15. Mazur,P, "Principles of Cryobiology" in Life In the Frozen State, pp.37-51, Barry J. Fuller, et. al., Editors; CRC Press (2004).
16. Chamberlain,F, Vitrification arrives! Cryonics 2000 21(4):4-9.
17. Best,B, Long Life: Longevity through Technology, CI-VM-1 cryoprotectant and CI carrier solution used for vitrification 2007 Mar-Apr; 39(3-4):5-6.
18. Bald WB. On crystal size and cooling rate. J Microsc. 1986 Jul;143(Pt 1):89-102.
19. Wowk B, Leitl E, Rasch CM, Mesbah-Karimi N, Harris SB, Fahy GM. Vitrification enhancement by synthetic ice blocking agents. Cryobiology. 2000 May;40(3):228-36.
20. Fahy GM, Lilley TH, Linsdell H, Douglas MS, Meryman HT. Cryoprotectant toxicity and cryoprotectant toxicity reduction: in search of molecular mechanisms. Cryobiology. 1990 Jun;27(3):247-68.
21. Fahy GM, Wowk B, Wu J, Paynter S. Improved vitrification solutions based on the predictability of vitrification solution toxicity. Cryobiology. 2004 Feb;48(1):22-35.
22. Fahy GM, Wowk B, Wu J, Phan J, Rasch C, Chang A, Zendejas E. Cryopreservation of organs by vitrification: perspectives and recent advances. Cryobiology. 2004 Apr;48(2):157-78.
23. Hasegawa A, Mochida N, Ogasawara T, Koyama K. Pup birth from mouse oocytes in preantral follicles derived from vitrified and warmed ovaries followed by in vitro growth, in vitro maturation, and in vitro fertilization. Fertil Steril. 2006 Oct;86 Suppl 4:1182-92.
24. Pichugin Y, Fahy GM, Morin R. Cryopreservation of rat hippocampal slices by vitrification. Cryobiology. 2006 Apr;52(2):228-40.
25. Fahy,GM, "Vitrification as an approach to cryopreservation: general perspectives", CRYOBIOLOGY; 51(3):348 (2005) [Abstract].
26. Lemler J, Harris SB, Platt C, Huffman TM. The arrest of biological time as a bridge to engineered negligible senescence. Ann N Y Acad Sci. 2004 Jun;1019:559-63.
27. Fahy GM, Saur J, Williams RJ. Physical problems with the vitrification of large biological systems. Cryobiology. 1990 Oct;27(5):492-510.
28. Baudot,A., Odagescu,V, "An automated cryostat designed to study the vitrification of cryoprotective solutions without any function", CRYOBIOLOGY 53:442 (2006) [Abstract].
По поводу влияния радиации на организм в анабиозе, упоминавшегося в статье: "При температуре жидкого азота ткани млекопитающих могут даже быть на протяжении многих столетий устойчивы к фоновой радиации." Вот здесь эта статья Мазура, на которую там дана ссылка:
Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol. 1984 Sep;247(3 Pt 1):C125-42."...Contrary to the usual impression, the challenge to cells during freezing is not their ability to endure storage at very low temperatures; rather it is the lethality of an intermediate zone of temperature (~ -15 to -60°C) that a cell must traverse twice-once during cooling and once during warming. No thermally driven reactions occur inaqueous systems at liquid N
2 temperatures (-196°C), the refrigerant commonly used for low temperature storage. One reason is that liquid water does not exist below -130°C. The only physical states that do exist are crystalline or glassy, and in both states the viscosity is sohigh (>10
13 poises) that diffusion is insignificant overless than geological time spans. Moreover, at -196°C, there is insufficient thermal energy for chemical reactions (67). The only reactions that can occur in frozen aqueoussystems at -196°C are photophysical events such as the formation of free radicals and the production of breaks in macromolecules as a direct result of “hits” by background ionizing radiation or cosmic rays (96). Over asufficiently long period of time, these direct ionization scan produce enough breaks or other damage in DNA to become deleterious after rewarming to physiological temperatures, especially since no enzymatic repair can occurat these very low temperatures. The dose of ionizingradiation that kills 63% of representative cultured mammalian cells at room temperature (l/e survival) is 200-400 rads (19). Because terresterial background radiationis some 0.1 rad/yr, it ought to require some 2,000-4,000 yr at -196°C to kill that fraction of a population of typical mammalian cells.
Needless to say, direct experimental confirmation of this prediction is lacking, but there is no confirmed case of cell death ascribable to storage at -196°C for some 2-15 yr and none even when cells are exposed to levels of ionizing radiation some 100 times background for up to 5 yr (48). Furthermore, there is no evidence that storageat -196°C results in the accumulation of chromosomalor genetic changes (6).
Stability for centuries or millenia requires temperatures below -130°C. Many cells stored above ~ -80°C are not stable, probably because traces of unfrozen solution still exist (54). They will die at rates ranging from several percent per hour to several percent per year depending on the temperature, the species and type of cell, and the composition of the medium in which they are frozen (52). Most implications and applications of freezing to biology arise from the effective stoppage of time at -196°C. But if cells are to be put in suspended animation, they must survive both the initial freezing to -196°C and the subsequent return to ambient temperatures..."
Влияние радиации на организмы при криогенных температурах пока вообще мало изучено, но вот свежая работа такого рода:
High survival of frozen cells irradiated with gamma radiation.Abstract
Cell storage in liquid nitrogen (LN) offers the most secure method of cell preservation even if cryopreserved cells are exposed to natural background of ionising radiation (IR). A lot of experiments have demonstrated that IR can induce damages in living cells, but only a little information regarding the response of cryopreserved cells is available. To investigate the effect of IR on frozen and unfrozen cells, peripheral blood mononuclear cells were directly irradiated at room temperature, then immediately frozen, or frozen and then irradiated in LN with different doses of gamma rays. After thawing, cells were incubated and death fraction was evaluated at different time points. Interestingly, the percentages of dead cells induced by IR gradually increased with both dose radiation and incubation time and were significantly lower for cells irradiated at -196°C than those irradiated at room temperature.
